BRCA1 je gen kódující lidský nádorový supresorový protein stejného jména, který hraje důležitou roli při udržování genomové stability. To zahrnuje aktivaci kontrolních bodů buněčného cyklu v odpovědi na poškození DNA a také samotnou opravu poškozené DNA. Některé zárodečné mutace v BRCA1 genu vedou u postižených jedinců k významné predispozici k malignitám, jakou jsou rakovina prsu a vaječníků.
Cílem této diplomové práce bylo studium haploinsuficience BRCA1 v unikátním buněčném modelu v podobě primárních porcinních fibroblastů. Jedná se o buněčné linie s konstitucí alel BRCA1 +/ a k nim kontrolní BRCA1 +/+, jež byly získány z nedávno vytvořeného GMO prasete. Prase je vhodným modelovým organismem pro lékařský výzkum, a to díky jeho relativní fyziologické podobnosti člověku. Na rozdíl od myších modelů je však tvorba GMO prasat velmi náročná a teprve až s moderními systémy genových "knock-inů" a "knock-outů" je lze využít i pro výzkum specifických lidských nemocí jako je rakovina.
U testovaných buněčných modelů byla nejprve optimalizována detekce a následně i srovnána míra exprese BRCA1 proteinu metodou western blotting. Linie byly dále testovány na citlivost vůči inhibitoru PARP1 enzymu, který patří mezi současná nejnadějnější léčiva ženských malignit. Inhibitory PARP1 se v terapii rakoviny ukazují jako obzvláště účinné v případech deficitu BRCA1 proteinu, kdy inhibice PARP1 enzymatické aktivity vede u postižených buněk k akumulaci toxického DNA poškození v podobě dvouvláknových DNA zlomů. Testy toxicity byly prováděny pomocí kolorometrické metody využívající druhou generaci tetrazoliových solí jejichž redukcí vzniká barevný formazan v důsledku metabolické aktivity buněk (tzv. XTT test).
Dále byla u modelu pomocí kvantitativní imunofluorescenční mikroskopie analyzována efektivita opravy dvouvláknových zlomů DNA. Výběrem vhodných protilátek byla analyzována oprava DNA zlomů jak pomocí homologní rekombinace, tak i nehomologního spojování volných DNA konců. Rovněž byla analyzována odpověď na replikační stres vedoucí k zastavení a kolapsu replikačních vidlic.
Protein BRCA1 byl úspěšně detekován ve všech testovaných liniích s nejsilnější expresí v linii 539 (+/+). Po podání inhibitoru PARP1 byla zaznamenána vyšší citlivosti haploinsuficientních linií. V případě efektivity oprav DNA lézí se podařilo optimalizovat a následně i kvantifikovat několik vhodných proteinových markerů, nicméně po ozáření buněk gama zářením se odpověď haploinsuficientních linií nelišila od kontrol. Také po expozici replikačnímu stresu nebyla u zkoumaných linií pozorována zásadně rozdílná akumulace defektní jedno-řetězcové DNA.
Anotace v angličtině
BRCA1 is a human tumour suppressor gene which product plays important role
in maintaining of genomic stability. That includes DNA-damage-induced cell cycle checkpoint activation and DNA damage repair. Some of the germline mutation in BRCA1 gene predispose mainly to breast and ovarian cancer.
The aim of this diploma thesis was to study an impact of haploinsufficiency of BRCA1 gene in a unique cellular model involving primary porcine fibroblasts. The used BRCA1 +/ and BRCA1 +/+ cell lines were derived from a recently developed GMO animals. The pig is an excellent model organism for medical research because of its physiological similarity with humans but instead of mouse models the GMO pig introduces much bigger technological challenge. The advanced technological solutions of knock-ins and knock-outs finally allow construction of cancer-relevant models.
In the primary porcine fibroblasts, the BRCA1 protein detection was optimised and compared between cell lines using western blot method. Cell lines were also tested for their sensitivity towards the PARP1 enzyme inhibitor, which belongs to the most promising treatments strategies of the woman malignancies currently available. Inhibitors of PARP1 seems to particularly effective in BRCA1 deficient backgrounds which fact is explained as accumulation of toxic double-stranded DNA lesions caused by PARP1 enzyme blockade which repair is vastly dependent on BRCA1 protein. The sensitivity of the cell lines was analysed calorimetrically using the second generation of tetrasolium salts which are reduced to coloured formazan in the presence of metabolically active cells (XTT test).
Next, the DNA lesions repair efficacy was analysed in the cell lines using quantitative imunofluorescence microscopy. The ability of cells to repair DNA lesions either by homologous recombination or by non-homologous enjoining explored in details. Cells were also flowed under the replication stress conditions which are causing stalling and collapses of replication forks and accumulation of single stranded DNA.
The BRCA1 protein was successfully detected in all tested porcine fibroblasts with the strongest expression in 539 (+/+) cell line. After the treatment with PARP1 inhibitor the haploinsufficient cell lines display higher sensitivity. In case of the repair efficacy of DNA lesions few antibodies were optimized against proper DNA lesion markers but the quantification of gamma irradiation induced DNA damage did not reveal any differences between the tested cell lines. Also the exposition of cells towards replication stress displayed constant increase in the amount of defective single stranded DNA throughout the all tested cell lines.
Klíčová slova
BRCA1; rakovina; haploinsuficience; odpověď na poškození DNA; dvouvláknové DNA zlomy; mutace; porcinní model
Klíčová slova v angličtině
BRCA1; cancer; haploinsufficiency; DNA damage response; double-strand-breaks (DSBs); mutations; porcine model
Rozsah průvodní práce
78 s. (146 726 znaků)
Jazyk
CZ
Anotace
BRCA1 je gen kódující lidský nádorový supresorový protein stejného jména, který hraje důležitou roli při udržování genomové stability. To zahrnuje aktivaci kontrolních bodů buněčného cyklu v odpovědi na poškození DNA a také samotnou opravu poškozené DNA. Některé zárodečné mutace v BRCA1 genu vedou u postižených jedinců k významné predispozici k malignitám, jakou jsou rakovina prsu a vaječníků.
Cílem této diplomové práce bylo studium haploinsuficience BRCA1 v unikátním buněčném modelu v podobě primárních porcinních fibroblastů. Jedná se o buněčné linie s konstitucí alel BRCA1 +/ a k nim kontrolní BRCA1 +/+, jež byly získány z nedávno vytvořeného GMO prasete. Prase je vhodným modelovým organismem pro lékařský výzkum, a to díky jeho relativní fyziologické podobnosti člověku. Na rozdíl od myších modelů je však tvorba GMO prasat velmi náročná a teprve až s moderními systémy genových "knock-inů" a "knock-outů" je lze využít i pro výzkum specifických lidských nemocí jako je rakovina.
U testovaných buněčných modelů byla nejprve optimalizována detekce a následně i srovnána míra exprese BRCA1 proteinu metodou western blotting. Linie byly dále testovány na citlivost vůči inhibitoru PARP1 enzymu, který patří mezi současná nejnadějnější léčiva ženských malignit. Inhibitory PARP1 se v terapii rakoviny ukazují jako obzvláště účinné v případech deficitu BRCA1 proteinu, kdy inhibice PARP1 enzymatické aktivity vede u postižených buněk k akumulaci toxického DNA poškození v podobě dvouvláknových DNA zlomů. Testy toxicity byly prováděny pomocí kolorometrické metody využívající druhou generaci tetrazoliových solí jejichž redukcí vzniká barevný formazan v důsledku metabolické aktivity buněk (tzv. XTT test).
Dále byla u modelu pomocí kvantitativní imunofluorescenční mikroskopie analyzována efektivita opravy dvouvláknových zlomů DNA. Výběrem vhodných protilátek byla analyzována oprava DNA zlomů jak pomocí homologní rekombinace, tak i nehomologního spojování volných DNA konců. Rovněž byla analyzována odpověď na replikační stres vedoucí k zastavení a kolapsu replikačních vidlic.
Protein BRCA1 byl úspěšně detekován ve všech testovaných liniích s nejsilnější expresí v linii 539 (+/+). Po podání inhibitoru PARP1 byla zaznamenána vyšší citlivosti haploinsuficientních linií. V případě efektivity oprav DNA lézí se podařilo optimalizovat a následně i kvantifikovat několik vhodných proteinových markerů, nicméně po ozáření buněk gama zářením se odpověď haploinsuficientních linií nelišila od kontrol. Také po expozici replikačnímu stresu nebyla u zkoumaných linií pozorována zásadně rozdílná akumulace defektní jedno-řetězcové DNA.
Anotace v angličtině
BRCA1 is a human tumour suppressor gene which product plays important role
in maintaining of genomic stability. That includes DNA-damage-induced cell cycle checkpoint activation and DNA damage repair. Some of the germline mutation in BRCA1 gene predispose mainly to breast and ovarian cancer.
The aim of this diploma thesis was to study an impact of haploinsufficiency of BRCA1 gene in a unique cellular model involving primary porcine fibroblasts. The used BRCA1 +/ and BRCA1 +/+ cell lines were derived from a recently developed GMO animals. The pig is an excellent model organism for medical research because of its physiological similarity with humans but instead of mouse models the GMO pig introduces much bigger technological challenge. The advanced technological solutions of knock-ins and knock-outs finally allow construction of cancer-relevant models.
In the primary porcine fibroblasts, the BRCA1 protein detection was optimised and compared between cell lines using western blot method. Cell lines were also tested for their sensitivity towards the PARP1 enzyme inhibitor, which belongs to the most promising treatments strategies of the woman malignancies currently available. Inhibitors of PARP1 seems to particularly effective in BRCA1 deficient backgrounds which fact is explained as accumulation of toxic double-stranded DNA lesions caused by PARP1 enzyme blockade which repair is vastly dependent on BRCA1 protein. The sensitivity of the cell lines was analysed calorimetrically using the second generation of tetrasolium salts which are reduced to coloured formazan in the presence of metabolically active cells (XTT test).
Next, the DNA lesions repair efficacy was analysed in the cell lines using quantitative imunofluorescence microscopy. The ability of cells to repair DNA lesions either by homologous recombination or by non-homologous enjoining explored in details. Cells were also flowed under the replication stress conditions which are causing stalling and collapses of replication forks and accumulation of single stranded DNA.
The BRCA1 protein was successfully detected in all tested porcine fibroblasts with the strongest expression in 539 (+/+) cell line. After the treatment with PARP1 inhibitor the haploinsufficient cell lines display higher sensitivity. In case of the repair efficacy of DNA lesions few antibodies were optimized against proper DNA lesion markers but the quantification of gamma irradiation induced DNA damage did not reveal any differences between the tested cell lines. Also the exposition of cells towards replication stress displayed constant increase in the amount of defective single stranded DNA throughout the all tested cell lines.
Klíčová slova
BRCA1; rakovina; haploinsuficience; odpověď na poškození DNA; dvouvláknové DNA zlomy; mutace; porcinní model
Klíčová slova v angličtině
BRCA1; cancer; haploinsufficiency; DNA damage response; double-strand-breaks (DSBs); mutations; porcine model
Zásady pro vypracování
- Pracování s buněčnými liniemi: fibroblasty z kůže wt BRCA1 a BRCA1 +/- modelového organismu.
- Určení celkové úrovně BRCA1 proteinu ve wt BRCA1 a BRCA1 +/- buňkách pomocí Western blotu.
- Srovnání citlivosti wt BRCA1 a BRCA1 +/- buněk na PARP1 inhibitor pomocí XTT testu.
- Kvantifikace opravy dvouvláknových zlomů homologní rekombinací ve wt BRCA1 a BRCA +/- po replikačním stresu a ozáření pomocí imunofluorescenční analýzy Rad51 a dalších proteinů, které se podílejí na opravě DNA poškození.
- Dopad na NHEJ v BRCA1 +/- buňkách po replikačním stresu pomocí imunofluorescenční analýzy proteinu 53BP1.
- Analýza opravy zastavené replikační vidličky imunofluorescenční analýzou fosforylovaného proteinu RPA32.
Zásady pro vypracování
- Pracování s buněčnými liniemi: fibroblasty z kůže wt BRCA1 a BRCA1 +/- modelového organismu.
- Určení celkové úrovně BRCA1 proteinu ve wt BRCA1 a BRCA1 +/- buňkách pomocí Western blotu.
- Srovnání citlivosti wt BRCA1 a BRCA1 +/- buněk na PARP1 inhibitor pomocí XTT testu.
- Kvantifikace opravy dvouvláknových zlomů homologní rekombinací ve wt BRCA1 a BRCA +/- po replikačním stresu a ozáření pomocí imunofluorescenční analýzy Rad51 a dalších proteinů, které se podílejí na opravě DNA poškození.
- Dopad na NHEJ v BRCA1 +/- buňkách po replikačním stresu pomocí imunofluorescenční analýzy proteinu 53BP1.
- Analýza opravy zastavené replikační vidličky imunofluorescenční analýzou fosforylovaného proteinu RPA32.
Seznam doporučené literatury
Luo Y, Li J, Liu Y, Lin L, Du Y, Li S, Yang H, Vajta G, Callesen H, Bolund L, Sorensen CB (2011) High efficiency of BRCA1 knockout using rAAV-mediated gene targeting: developing a pig model for breast cancer. Transgenic Res; 20(5):975-88.
Sedic M, Skibinski A, Brown N, Gallardo M, Mulligan P, Martinez P, Keller PJ, Glover E, Richardson AL, Cowan J, Toland AE, Ravichandran K, Riethman H, Naber SP, Näär AM, Blasco MA, Hinds PW, Kuperwasser C (2015) Haploinsufficiency for BRCA1 leads to cell-type-specific genomic instability and premature senescence. Nat Commun; 6:7505.
Konishi H, Mohseni M, Tamaki A, Garay JP, Croessmann S, Karnan S, Ota A, Wong HY, Konishi Y, Karakas B, Tahir K, Abukhdeir AM, Gustin JP, Cidado J, Wang GM, Cosgrove D, Cochran R, Jelovac D, Higgins MJ, Arena S, Hawkins L, Lauring J, Gross AL, Heaphy CM, Hosokawa Y, Gabrielson E, Meeker AK, Visvanathan K, Argani P, Bachman KE, Park BH (2011) Mutation of a single allele of the cancer susceptibility gene BRCA1 leads to genomic instability in human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A; 108(43):17773-8.
Vaclová T, Gómez-López G, Setién F, Bueno JM, Macías JA, Barroso A, Urioste M, Esteller M, Benítez J, Osorio A (2015) DNA repair capacity is impaired in healthy BRCA1 heterozygous mutation carriers. Breast Cancer Res Treat; 152(2):271-82.
Pathania S, Bade S, Le Guillou M, Burke K, Reed R, Bowman-Colin C, Su Y, Ting DT, Polyak K, Richardson AL, Feunteun J, Garber JE, Livingston DM (2014) BRCA1 haploinsufficiency for replication stress suppression in primary cells. Nat Commun; 5:5496.
Brown AD, Claybon AB, Bishop AJ (2011) A conditional mouse model for measuring the frequency of homologous recombination events in vivo in the absence of essential genes. Mol Cell Biol; 31(17):3593-602.
Zhang J (2013) The role of BRCA1 in homologous recombination repair in response to replication stress: significance in tumorigenesis and cancer therapy. Cell Biosci; 3(1):11.
Zhang J, Dai Q, Park D, Deng X (2016) Targeting DNA Replication Stress for Cancer Therapy. Genes (Basel); 7(8). pii: E51.
Diaz-Cruz ES, Cabrera MC, Nakles R, Rutstein BH & Furth PA (2010) BRCA1 deficient mouse models to study pathogenesis and therapy of triple negative breast cancer. Breast Dis; 32:8597.
Seznam doporučené literatury
Luo Y, Li J, Liu Y, Lin L, Du Y, Li S, Yang H, Vajta G, Callesen H, Bolund L, Sorensen CB (2011) High efficiency of BRCA1 knockout using rAAV-mediated gene targeting: developing a pig model for breast cancer. Transgenic Res; 20(5):975-88.
Sedic M, Skibinski A, Brown N, Gallardo M, Mulligan P, Martinez P, Keller PJ, Glover E, Richardson AL, Cowan J, Toland AE, Ravichandran K, Riethman H, Naber SP, Näär AM, Blasco MA, Hinds PW, Kuperwasser C (2015) Haploinsufficiency for BRCA1 leads to cell-type-specific genomic instability and premature senescence. Nat Commun; 6:7505.
Konishi H, Mohseni M, Tamaki A, Garay JP, Croessmann S, Karnan S, Ota A, Wong HY, Konishi Y, Karakas B, Tahir K, Abukhdeir AM, Gustin JP, Cidado J, Wang GM, Cosgrove D, Cochran R, Jelovac D, Higgins MJ, Arena S, Hawkins L, Lauring J, Gross AL, Heaphy CM, Hosokawa Y, Gabrielson E, Meeker AK, Visvanathan K, Argani P, Bachman KE, Park BH (2011) Mutation of a single allele of the cancer susceptibility gene BRCA1 leads to genomic instability in human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A; 108(43):17773-8.
Vaclová T, Gómez-López G, Setién F, Bueno JM, Macías JA, Barroso A, Urioste M, Esteller M, Benítez J, Osorio A (2015) DNA repair capacity is impaired in healthy BRCA1 heterozygous mutation carriers. Breast Cancer Res Treat; 152(2):271-82.
Pathania S, Bade S, Le Guillou M, Burke K, Reed R, Bowman-Colin C, Su Y, Ting DT, Polyak K, Richardson AL, Feunteun J, Garber JE, Livingston DM (2014) BRCA1 haploinsufficiency for replication stress suppression in primary cells. Nat Commun; 5:5496.
Brown AD, Claybon AB, Bishop AJ (2011) A conditional mouse model for measuring the frequency of homologous recombination events in vivo in the absence of essential genes. Mol Cell Biol; 31(17):3593-602.
Zhang J (2013) The role of BRCA1 in homologous recombination repair in response to replication stress: significance in tumorigenesis and cancer therapy. Cell Biosci; 3(1):11.
Zhang J, Dai Q, Park D, Deng X (2016) Targeting DNA Replication Stress for Cancer Therapy. Genes (Basel); 7(8). pii: E51.
Diaz-Cruz ES, Cabrera MC, Nakles R, Rutstein BH & Furth PA (2010) BRCA1 deficient mouse models to study pathogenesis and therapy of triple negative breast cancer. Breast Dis; 32:8597.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu diplomové práce studentky Bc. Terezy Buchtové zahájil doc. Ing. Radim Vrzal, Ph.D. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudku vedoucí práce Mgr. Dušany Majera, Ph.D. a oponenta doc. RNDr. Vladimíra Kryštofa, Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
" BRCA1 - uplatnění v organizmu, mutace
" Prase a jeho využití jako modelový organismus
" Prasečí fibroblasty jako modelový systém
" Experimentální provedení práce
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
" Objasnění pojmů heterozygot, hemizygot a haploinsuficience
" Interakce protilátek s porcinním proteinem BRCA1
" Rozdíl hodnot mezi liniemi buněk 538 a 539
" Formace fokusů v buňkách 539 inhibitorem replikace
" Biologický původ fibroblastů
" BRCA1 a beta-aktin, srovnání výsledků westernblotů
Studentka na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagovala věcně a přiměřeně.
Hodnocení: B