Neurosteroidy jsou látky významně ovlivňující činnost nervových buněk. Hrají tedy významnou úlohu u řady fyziologických (úzkost, procesy učení a paměti) i patofyziologických funkcí (stres, neurodegenerativní choroby). Tato diplomové práce se zabývá popisem neurosteroidů, jejich metabolismu, účinků i způsobů jejich detekce. Cílem práce bylo porovnání purifikačních metod extrakce na pevné fázi s precipitací proteinů srážedlem a nalezení optimálních podmínek pro UHPLC-MS/MS analýzu. Nejvhodnější purifikační protokol využívající kolony Strata-X společně s optimalizovanou UHPLC-MS/MS analýzou byly následně aplikovány na vzorky krevního séra a mozkomíšního moku pacientů s roztroušenou sklerózou a předpokládaných zdravých dárců. Hladiny neurosteroidů DHEA a testosteronu se lišily pouze fyziologicky, avšak u pacientek s roztroušenou sklerózou došlo ke zvýšení hladin progesteronu v krevním séru. Poznání tvorby neurosteroidů i jejich správnou detekcí může být využito v prevenci a léčbě nejen roztroušené sklerózy, ale i dalších neurodegenerativních a psychiatrických onemocnění.
Anotace v angličtině
Neurosteroids are substances that significantly modulate activity of nerve cells. They play an important role in a number of physiological (anxiety, learning and memory processes) and pathophysiological (stress, neurodegenerative diseases) functions. The Master's thesis deals with the description of neurosteroids, their metabolism, physiological effects and detection methods. The aim of this thesis was also to compare protein precipitation with purification methods using solid phase extraction and to find optimal conditions for UHPLC-MS/MS analysis. The most appropriate method, Strata-X column purification and optimized UHPLC-MS/MS analysis were then applied to analyse the neurosteroids in blood serum and CSF samples of patients with multiple sclerosis and presumed healthy donors. DHEA and testosterone levels differed only physiologically, but in patients with multiple sclerosis, levels progesterone in serum have increased. Knowledge of neurosteroid formation and their correct detection can be used to prevent and treat not only multiple sclerosis but also other neurodegenerative and psychiatric diseases.
Neurosteroidy jsou látky významně ovlivňující činnost nervových buněk. Hrají tedy významnou úlohu u řady fyziologických (úzkost, procesy učení a paměti) i patofyziologických funkcí (stres, neurodegenerativní choroby). Tato diplomové práce se zabývá popisem neurosteroidů, jejich metabolismu, účinků i způsobů jejich detekce. Cílem práce bylo porovnání purifikačních metod extrakce na pevné fázi s precipitací proteinů srážedlem a nalezení optimálních podmínek pro UHPLC-MS/MS analýzu. Nejvhodnější purifikační protokol využívající kolony Strata-X společně s optimalizovanou UHPLC-MS/MS analýzou byly následně aplikovány na vzorky krevního séra a mozkomíšního moku pacientů s roztroušenou sklerózou a předpokládaných zdravých dárců. Hladiny neurosteroidů DHEA a testosteronu se lišily pouze fyziologicky, avšak u pacientek s roztroušenou sklerózou došlo ke zvýšení hladin progesteronu v krevním séru. Poznání tvorby neurosteroidů i jejich správnou detekcí může být využito v prevenci a léčbě nejen roztroušené sklerózy, ale i dalších neurodegenerativních a psychiatrických onemocnění.
Anotace v angličtině
Neurosteroids are substances that significantly modulate activity of nerve cells. They play an important role in a number of physiological (anxiety, learning and memory processes) and pathophysiological (stress, neurodegenerative diseases) functions. The Master's thesis deals with the description of neurosteroids, their metabolism, physiological effects and detection methods. The aim of this thesis was also to compare protein precipitation with purification methods using solid phase extraction and to find optimal conditions for UHPLC-MS/MS analysis. The most appropriate method, Strata-X column purification and optimized UHPLC-MS/MS analysis were then applied to analyse the neurosteroids in blood serum and CSF samples of patients with multiple sclerosis and presumed healthy donors. DHEA and testosterone levels differed only physiologically, but in patients with multiple sclerosis, levels progesterone in serum have increased. Knowledge of neurosteroid formation and their correct detection can be used to prevent and treat not only multiple sclerosis but also other neurodegenerative and psychiatric diseases.
Teoretická část zahrnuje vypracování literární rešerše a získání přehledu o současném stavu dané problematiky přehled biosyntézy, metabolismu a účinku neurosteroidů, seznámení s problematikou stanovení steroidních látek a používanými metodami. Praktická část se zabývá vývojem metody pro stanovení neurosteroidů pomocí UHPLC-MS/MS, vyhodnocením a interpretací naměřených dat.
Zásady pro vypracování
Teoretická část zahrnuje vypracování literární rešerše a získání přehledu o současném stavu dané problematiky přehled biosyntézy, metabolismu a účinku neurosteroidů, seznámení s problematikou stanovení steroidních látek a používanými metodami. Praktická část se zabývá vývojem metody pro stanovení neurosteroidů pomocí UHPLC-MS/MS, vyhodnocením a interpretací naměřených dat.
Seznam doporučené literatury
Baulieu EE. Neurosteroids: a novel function of the brain. Psychoneuroendocrinology, 1998, 23(8), 963-987.
Dury A., et al. Validated LCMS/MS simultaneous assay of five sex steroid/neurosteroid-related sulfates in human serum. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 149, 1-10.
Giatti S., et al.. Neuroactive steroids and the peripheral nervous system: An update. Steroids, 2015, 103, 23-30.
Hényková E., et al. Stable isotope dilution ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry quantitative profiling of tryptophan-related neuroactive substances in human serum and cerebrospinal fluid. Journal of Chromatography A, 2016, 1437, 145-157.
Korinek M., et al. Review: Neurosteroid modulation of N-methyl-d-aspartate receptors. Steroids, 2011, 76(13), 1409-1418.
Melcangi R.C., et al. Neuroactive steroids: Old players in a new game. Neuroscience, 2006, 138(3), 733-739.
Pennell K.D., et al. Quantification of neurosteroids during pregnancy using selective ion monitoring mass spectrometry. Steroids, 2015, 95, 24-31.
Sosvorova L., et al. Determination of seven selected neuro- and immunomodulatory steroids in human cerebrospinal fluid and plasma using LC-MS/MS. Steroids, 2015, 98, 1-8.
Wang Y., et al. Analysis of neurosterols and neurosteroids by mass spectrometry. Biochimie, 2007, 89(2), 182-191.
Seznam doporučené literatury
Baulieu EE. Neurosteroids: a novel function of the brain. Psychoneuroendocrinology, 1998, 23(8), 963-987.
Dury A., et al. Validated LCMS/MS simultaneous assay of five sex steroid/neurosteroid-related sulfates in human serum. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 149, 1-10.
Giatti S., et al.. Neuroactive steroids and the peripheral nervous system: An update. Steroids, 2015, 103, 23-30.
Hényková E., et al. Stable isotope dilution ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry quantitative profiling of tryptophan-related neuroactive substances in human serum and cerebrospinal fluid. Journal of Chromatography A, 2016, 1437, 145-157.
Korinek M., et al. Review: Neurosteroid modulation of N-methyl-d-aspartate receptors. Steroids, 2011, 76(13), 1409-1418.
Melcangi R.C., et al. Neuroactive steroids: Old players in a new game. Neuroscience, 2006, 138(3), 733-739.
Pennell K.D., et al. Quantification of neurosteroids during pregnancy using selective ion monitoring mass spectrometry. Steroids, 2015, 95, 24-31.
Sosvorova L., et al. Determination of seven selected neuro- and immunomodulatory steroids in human cerebrospinal fluid and plasma using LC-MS/MS. Steroids, 2015, 98, 1-8.
Wang Y., et al. Analysis of neurosterols and neurosteroids by mass spectrometry. Biochimie, 2007, 89(2), 182-191.