Jelikož nanotechnologie přináší potenciál pro velké pokroky ve zdravotní péči, průmyslové sféře, a dokonce i v remediaci životního prostředí, zájem ohledně vývoje a využití nanomateriálů během posledních dvou desetiletí exponenciálně vzrostl. Díky své biokompatibilitě se velmi oblíbenými staly uhlíkové nanomateriály (uhlíkové a grafenové tečky) nacházející široké uplatnění v biomedicínských aplikacích. Jednou z nejnovějších senzací v této oblasti je dvoudimenzionální uhlíkový materiál známý jako grafen. Navzdory faktu, že výzkum zaměřený na technické a bio-medicinální využití grafenu a jeho derivátů se rozvíjí velmi rychle, pouze málo je známo o jejich interakci s biologickými systémy či toxicitě. Grafen oxid disponuje velkým měrným povrchem (2600 m2/g), který mu propůjčuje vysokou kapacitu pro vazbu léčiv. Mimo jiné byla jako nežádoucí zjištěna zvýšená absorpce nepolárních kontaminantů životního prostředí u ryb, která vedla ke zvýšené indukci cytochromu P450 1A (cyp1A) zprostředkované aryluhlovodíkovým receptorem (AhR) ve srovnání s aktivátory AhR samotnými. Grafen oxid může tímto způsobem vykazovat účinky na další xenoreceptory, např. pregnanový X receptor (PXR), který je díky své široké substrátové specifitě k řadě cizorodých i tělu vlastních látek zodpovědný za kontrolu exprese mnoha genů zapojených do biotransformace léčiv. Cílem této práce je zjistit, zda grafen oxid ovlivňuje signalizaci pregnanového X receptoru (PXR) s následným dopadem na lidské zdraví skrz změnu exprese relevantních cílových genů, konkrétně CYP3A4 a MDR1. Možné cyto-toxické působení grafen oxidu bylo studováno prostřednictvím MTT testu. Pomocí techniky gene reporter assay byla zkoumána schopnost PXR aktivovat promotor CYP3A4 v přítomnosti GO. Poté s využitím metod qRT-PCR, a western blotting s imunodetekcí dle Sally Sue, byla sledována exprese u genů CYP3A4 a MDR1, a to jak na úrovni mRNA, tak i na úrovni proteinů. Výsledky naznačují, že GO nanočástice ovlivňují signální dráhu jaderného pregnanového X receptoru, a to jak na úrovni transkripční (antagonistický mód), tak i na úrovni translační (agonistický i antagonistický mód). Přičemž efekt grafen oxidových nanočástic je závislý koncentraci těchto částic. Lze tedy předpokládat vznik možných lékových interakcí s dopadem na lidské zdraví.
Anotace v angličtině
Since nanotechnology holds out the promise of great improvements in healthcare, industrial technologies, and even in the remediation of the environment, the interest in exploration and application of nanomaterials has grown exponentially over the past two decades. Due to good biocompatibility, carbon nanomaterials (carbon and graphene dots) became very popular in broad spectrum of bio-medicinal applications. One of the latest sensations in the field of nanomaterials is a two-dimensional carbon material known as graphene. Despite the fact, that the research focused on technical and biomedical requests using graphene and its derivatives is expanding quickly, merely little is known about their interaction with the biological systems or internal toxicity. Graphene oxide owns large surface area (2600 m2/g), which allows it to absorb drugs with remarkable capacity. However, undesirable GO-mediated higher cellular absorption of organic pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons and polychlorinated biphenyls leading to increased induction of cytochrome P450 1A (cyp1A), mediated by aryl hydrocarbon receptor (AhR), was observed. To this end, we decided to investigate whether the graphene oxide may influence other nuclear receptors as well, specifically the pregnane X receptor (PXR) in humans. PXR is a promiscuous nuclear receptor that responds to a variety of endogenous and exogenous substances. Moreover, PXR plays a crucial role in a drug metabolism. We studied the potential hazardous effect of GO with the focus on the PXR-target genes, CYP3A4 and MDR1 respectively. Potential GO cytotoxicity was examined by MTT test. In addition, using a reporter gene assay, we monitored the ability of PXR to activate CYP3A4 promoter in LS180 cell line during GO treatment. Moreover, employing methods like qRT-PCR, SDS-PAGE, western blotting and immunodetection using Sally Sue, we monitored the expressions of CYP3A4 and MDR1 genes at mRNA and protein levels. Our results indicate that graphene oxide nanoparticles dose-dependently influence the PXR signaling pathway, not only at the transcriptional level (antagonistic mode) but also at the translational level (agonistic and antagonistic mode), and therefore they may cause drug-drug interactions and have an impact on human health.
Jelikož nanotechnologie přináší potenciál pro velké pokroky ve zdravotní péči, průmyslové sféře, a dokonce i v remediaci životního prostředí, zájem ohledně vývoje a využití nanomateriálů během posledních dvou desetiletí exponenciálně vzrostl. Díky své biokompatibilitě se velmi oblíbenými staly uhlíkové nanomateriály (uhlíkové a grafenové tečky) nacházející široké uplatnění v biomedicínských aplikacích. Jednou z nejnovějších senzací v této oblasti je dvoudimenzionální uhlíkový materiál známý jako grafen. Navzdory faktu, že výzkum zaměřený na technické a bio-medicinální využití grafenu a jeho derivátů se rozvíjí velmi rychle, pouze málo je známo o jejich interakci s biologickými systémy či toxicitě. Grafen oxid disponuje velkým měrným povrchem (2600 m2/g), který mu propůjčuje vysokou kapacitu pro vazbu léčiv. Mimo jiné byla jako nežádoucí zjištěna zvýšená absorpce nepolárních kontaminantů životního prostředí u ryb, která vedla ke zvýšené indukci cytochromu P450 1A (cyp1A) zprostředkované aryluhlovodíkovým receptorem (AhR) ve srovnání s aktivátory AhR samotnými. Grafen oxid může tímto způsobem vykazovat účinky na další xenoreceptory, např. pregnanový X receptor (PXR), který je díky své široké substrátové specifitě k řadě cizorodých i tělu vlastních látek zodpovědný za kontrolu exprese mnoha genů zapojených do biotransformace léčiv. Cílem této práce je zjistit, zda grafen oxid ovlivňuje signalizaci pregnanového X receptoru (PXR) s následným dopadem na lidské zdraví skrz změnu exprese relevantních cílových genů, konkrétně CYP3A4 a MDR1. Možné cyto-toxické působení grafen oxidu bylo studováno prostřednictvím MTT testu. Pomocí techniky gene reporter assay byla zkoumána schopnost PXR aktivovat promotor CYP3A4 v přítomnosti GO. Poté s využitím metod qRT-PCR, a western blotting s imunodetekcí dle Sally Sue, byla sledována exprese u genů CYP3A4 a MDR1, a to jak na úrovni mRNA, tak i na úrovni proteinů. Výsledky naznačují, že GO nanočástice ovlivňují signální dráhu jaderného pregnanového X receptoru, a to jak na úrovni transkripční (antagonistický mód), tak i na úrovni translační (agonistický i antagonistický mód). Přičemž efekt grafen oxidových nanočástic je závislý koncentraci těchto částic. Lze tedy předpokládat vznik možných lékových interakcí s dopadem na lidské zdraví.
Anotace v angličtině
Since nanotechnology holds out the promise of great improvements in healthcare, industrial technologies, and even in the remediation of the environment, the interest in exploration and application of nanomaterials has grown exponentially over the past two decades. Due to good biocompatibility, carbon nanomaterials (carbon and graphene dots) became very popular in broad spectrum of bio-medicinal applications. One of the latest sensations in the field of nanomaterials is a two-dimensional carbon material known as graphene. Despite the fact, that the research focused on technical and biomedical requests using graphene and its derivatives is expanding quickly, merely little is known about their interaction with the biological systems or internal toxicity. Graphene oxide owns large surface area (2600 m2/g), which allows it to absorb drugs with remarkable capacity. However, undesirable GO-mediated higher cellular absorption of organic pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons and polychlorinated biphenyls leading to increased induction of cytochrome P450 1A (cyp1A), mediated by aryl hydrocarbon receptor (AhR), was observed. To this end, we decided to investigate whether the graphene oxide may influence other nuclear receptors as well, specifically the pregnane X receptor (PXR) in humans. PXR is a promiscuous nuclear receptor that responds to a variety of endogenous and exogenous substances. Moreover, PXR plays a crucial role in a drug metabolism. We studied the potential hazardous effect of GO with the focus on the PXR-target genes, CYP3A4 and MDR1 respectively. Potential GO cytotoxicity was examined by MTT test. In addition, using a reporter gene assay, we monitored the ability of PXR to activate CYP3A4 promoter in LS180 cell line during GO treatment. Moreover, employing methods like qRT-PCR, SDS-PAGE, western blotting and immunodetection using Sally Sue, we monitored the expressions of CYP3A4 and MDR1 genes at mRNA and protein levels. Our results indicate that graphene oxide nanoparticles dose-dependently influence the PXR signaling pathway, not only at the transcriptional level (antagonistic mode) but also at the translational level (agonistic and antagonistic mode), and therefore they may cause drug-drug interactions and have an impact on human health.
a) Osvojení experimentálních metodik specifických pro daný výzkum.
b) Příprava a plánování experimentů.
d) Provádění experimentů v rámci výzkumného plánu.
e) Optimalizace a návrh jiných postupů pro získání cíle.
f) Ověření výsledků v kontrolních experimentech.
g) Zaznamenání postupů a výsledků psanou a elektronickou formou.
h) Analýza výsledků a jejich statistické zpracování.
i) Zpracování literární rešerše shrnující prvky výzkumného tématu.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
a) Osvojení experimentálních metodik specifických pro daný výzkum.
b) Příprava a plánování experimentů.
d) Provádění experimentů v rámci výzkumného plánu.
e) Optimalizace a návrh jiných postupů pro získání cíle.
f) Ověření výsledků v kontrolních experimentech.
g) Zaznamenání postupů a výsledků psanou a elektronickou formou.
h) Analýza výsledků a jejich statistické zpracování.
i) Zpracování literární rešerše shrnující prvky výzkumného tématu.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
- Lammel T, Boisseaux P, Fernandez-Cruz ML, Navas JM. 2013. Internalization and cytotoxicity of graphene oxide and carboxyl graphene nanoplatelets in the human hepatocellular carcinoma cell line Hep G2. Part Fibre Toxicol 10:27.
- Lammel T, Navas JM. 2014. Graphene nanoplatelets spontaneously translocate into the cytosol and physically interact with cellular organelles in the fish cell line PLHC-1. Aquat Toxicol 150:55-65.
- Skálová, L., Boušová, I., Machala, M., Pávek, P., Podlipná, R., Souček, P., Szotáková, B., Vondráček, J., Wsól, V., Metabolismus léčiv a jiných xenobiotik.1. vyd. Praha: Karolinum, 2011.-162 s. 978-80-246-1917-0.
- Oberdorster G, Oberdorster E, Oberdorster J. 2007. Concepts of nanoparticle dose metric and response metric. Environmental health perspectives 115(6):A290.
Seznam doporučené literatury
- Lammel T, Boisseaux P, Fernandez-Cruz ML, Navas JM. 2013. Internalization and cytotoxicity of graphene oxide and carboxyl graphene nanoplatelets in the human hepatocellular carcinoma cell line Hep G2. Part Fibre Toxicol 10:27.
- Lammel T, Navas JM. 2014. Graphene nanoplatelets spontaneously translocate into the cytosol and physically interact with cellular organelles in the fish cell line PLHC-1. Aquat Toxicol 150:55-65.
- Skálová, L., Boušová, I., Machala, M., Pávek, P., Podlipná, R., Souček, P., Szotáková, B., Vondráček, J., Wsól, V., Metabolismus léčiv a jiných xenobiotik.1. vyd. Praha: Karolinum, 2011.-162 s. 978-80-246-1917-0.
- Oberdorster G, Oberdorster E, Oberdorster J. 2007. Concepts of nanoparticle dose metric and response metric. Environmental health perspectives 115(6):A290.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
prof. Šebela: Jak je možné převést grafenoxid do roztoku? Používáte suspenzi? Buňky jste inkubovali se suspenzí?
dr. Kopečný: Jak je definovaný a charakterizovaný grafenoxid? Jaká je cena jedné reakce u metody Sally Sue Protein Simple analysis?
doc. Luhová: Proč se studuje vliv grafenoxidu? Používá se jako nosič pro nějaká léčiva?