Aryluhlovodíkový receptor (AhR) je ligandy aktivovaný transkripční faktor zodpovědný za regulaci exprese enzymů metabolizujících xenobiotika. Aktivita tohoto receptoru je ovlivňována vazbou ligandu a posttranslačními modifikacemi, především fosforylací. V bakalářské práci jsem ukázala, že inhibice serin/threoninové kinázy mTOR látkou rapamycinem potencuje signalizaci AhR v přítomnosti ligandu. Signální dráha mTOR je zodpovědná za velké množství nitrobuněčných procesů jako jsou proliferace, apoptóza či organizace buněčného cytoskeletu. Deregulace této dráhy je spojená s procesem karcinogeneze, tudíž se její inhibice stala nadějí léčby nádorových onemocnění.
V diplomové práci byl zkoumán vliv duálních ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy, INK 128, AZD2014 a OSI-027, na signalizaci AhR v přítomnosti jeho ligandů v buněčné linii HepG2 odvozené od hepatocelulárního karcinomu. Nejprve byly určeny netoxické koncentrace testovaných látek metodou MTT a následně stanoveny inhibiční účinky na komplexy mTORC1/C2 metodou Western blotting. Úroveň aktivity AhR byla detekovaná metodou Gene reporter assay a enzymová aktivita CYP1A1 metodou EROD. Hladina CYP1A1 mRNA byla stanovena metodou real-time PCR.
Bylo zjištěno, že komplex mTORC2 není za daných podmínek v buněčné linii aktivován, tudíž nebylo možné prokázat duální účinek inhibitorů. Kombinace testovaných látek s aktivátorem AhR 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinem (TCDD) potencovala transkripční aktivitu AhR a expresi CYP1A1 mRNA v závislosti na zvyšující se koncentraci látek. Byla také pozorována indukce katalytické aktivity CYP1A1, která ovšem s rostoucí koncentrací testovaných látek klesala. Samotné inhibitory mTOR neměly vliv na hladinu CYP1A1 mRNA, enzymovou aktivitu CYP1A1 ani na aktivitu AhR.
Tato práce ukázala, že ATP-kompetitivní inhibitory mTOR kinázy potencují účinek aktivace AhR ligandem dioxinem a že mTOR signální dráha ovlivňuje regulaci AhR.
Anotace v angličtině
Aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a ligand-activated transcription factor involved in regulation of xenobiotic-metabolizing enzymes. It is activated by ligands or posttranscriptional modifications, especially phosphorylation. In my bachelor thesis, I found that serine/threonine-specific protein kinase mTOR affected dioxin-inducible AhR-dependent CYP1A1 expression in the presence of mTOR inhibitor, rapamycin. AhR regulator which affects its signaling in the presence of ligands. mTOR signaling pathway is responsible for a large number of intracellular processes such as proliferation, apoptosis and cytoskeletal organization. Deregulation of this pathway is associated with a carcinogenesis and its inhibition can be considered as a cancer treatment.
This thesis focuses on the influence of ATP-competitive inhibitors of mTOR, namely INK 128, AZD2014 and OSI-027, on signalisation mediated by the AhR in HepG2 cell line derived from hepatocellular carcinoma. Firstly, the non-toxic concentrations of the substances were determined by MTT method and then the inhibitor's effects on complexes mTORC1/C2 by Western blotting. The level of AhR activity was detected by Reporter gene assay and the enzymatic aktivity of CYP1A1 by EROD method. CYP1A1 mRNA levels were monitored by real-time PCR.
Complex mTORC2 is not activated in the cell line under these condition. Therefore a dual effect of inhibitors was not proved. The substances were tested itself and in the combination with 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). The TCDD-inducible level of CYP1A1 mRNA and transcriptional activity of AhR were increased in the presence of mTOR inhibitors in dose-dependent manner. The induction of TCDD-inducible catalytic activity of CYP1A1 was also observed. However, it was decreased in dose-dependent manner of tested substances. mTOR inhibitors itself had no effect on CYP1A1 mRNA, CYP1A1 enzyme activity and AhR activity.
The results suggest that ATP-competitive inhibitors of mTOR potentiate effect of AhR signaling activation in the presence of its ligand dioxin and that mTOR affects AhR signalling.
Aryluhlovodíkový receptor (AhR) je ligandy aktivovaný transkripční faktor zodpovědný za regulaci exprese enzymů metabolizujících xenobiotika. Aktivita tohoto receptoru je ovlivňována vazbou ligandu a posttranslačními modifikacemi, především fosforylací. V bakalářské práci jsem ukázala, že inhibice serin/threoninové kinázy mTOR látkou rapamycinem potencuje signalizaci AhR v přítomnosti ligandu. Signální dráha mTOR je zodpovědná za velké množství nitrobuněčných procesů jako jsou proliferace, apoptóza či organizace buněčného cytoskeletu. Deregulace této dráhy je spojená s procesem karcinogeneze, tudíž se její inhibice stala nadějí léčby nádorových onemocnění.
V diplomové práci byl zkoumán vliv duálních ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy, INK 128, AZD2014 a OSI-027, na signalizaci AhR v přítomnosti jeho ligandů v buněčné linii HepG2 odvozené od hepatocelulárního karcinomu. Nejprve byly určeny netoxické koncentrace testovaných látek metodou MTT a následně stanoveny inhibiční účinky na komplexy mTORC1/C2 metodou Western blotting. Úroveň aktivity AhR byla detekovaná metodou Gene reporter assay a enzymová aktivita CYP1A1 metodou EROD. Hladina CYP1A1 mRNA byla stanovena metodou real-time PCR.
Bylo zjištěno, že komplex mTORC2 není za daných podmínek v buněčné linii aktivován, tudíž nebylo možné prokázat duální účinek inhibitorů. Kombinace testovaných látek s aktivátorem AhR 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinem (TCDD) potencovala transkripční aktivitu AhR a expresi CYP1A1 mRNA v závislosti na zvyšující se koncentraci látek. Byla také pozorována indukce katalytické aktivity CYP1A1, která ovšem s rostoucí koncentrací testovaných látek klesala. Samotné inhibitory mTOR neměly vliv na hladinu CYP1A1 mRNA, enzymovou aktivitu CYP1A1 ani na aktivitu AhR.
Tato práce ukázala, že ATP-kompetitivní inhibitory mTOR kinázy potencují účinek aktivace AhR ligandem dioxinem a že mTOR signální dráha ovlivňuje regulaci AhR.
Anotace v angličtině
Aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a ligand-activated transcription factor involved in regulation of xenobiotic-metabolizing enzymes. It is activated by ligands or posttranscriptional modifications, especially phosphorylation. In my bachelor thesis, I found that serine/threonine-specific protein kinase mTOR affected dioxin-inducible AhR-dependent CYP1A1 expression in the presence of mTOR inhibitor, rapamycin. AhR regulator which affects its signaling in the presence of ligands. mTOR signaling pathway is responsible for a large number of intracellular processes such as proliferation, apoptosis and cytoskeletal organization. Deregulation of this pathway is associated with a carcinogenesis and its inhibition can be considered as a cancer treatment.
This thesis focuses on the influence of ATP-competitive inhibitors of mTOR, namely INK 128, AZD2014 and OSI-027, on signalisation mediated by the AhR in HepG2 cell line derived from hepatocellular carcinoma. Firstly, the non-toxic concentrations of the substances were determined by MTT method and then the inhibitor's effects on complexes mTORC1/C2 by Western blotting. The level of AhR activity was detected by Reporter gene assay and the enzymatic aktivity of CYP1A1 by EROD method. CYP1A1 mRNA levels were monitored by real-time PCR.
Complex mTORC2 is not activated in the cell line under these condition. Therefore a dual effect of inhibitors was not proved. The substances were tested itself and in the combination with 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). The TCDD-inducible level of CYP1A1 mRNA and transcriptional activity of AhR were increased in the presence of mTOR inhibitors in dose-dependent manner. The induction of TCDD-inducible catalytic activity of CYP1A1 was also observed. However, it was decreased in dose-dependent manner of tested substances. mTOR inhibitors itself had no effect on CYP1A1 mRNA, CYP1A1 enzyme activity and AhR activity.
The results suggest that ATP-competitive inhibitors of mTOR potentiate effect of AhR signaling activation in the presence of its ligand dioxin and that mTOR affects AhR signalling.
1. Vypracování rešerše na téma diplomové práce
2. Určení netoxických koncentrací vybraných inhibitorů metodou MTT
3. Verifikace inhibičních účinků netoxických koncentrací inhibitorů na komplexy mTORC1/C2 metodou western blotting
4. Stanovení aktivity AhR metodou gene reporter assay v přítomnosti vybraných ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy
5. Analýza hladiny CYP1A1 mRNA metodou PCR v přítomnosti vybraných ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy
6. Stanovení enzymové aktivity CYP1A1 v přítomnosti vybraných ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy
7. Vypracování diplomové práce a multimediální prezentace k obhajobě diplomové práce
Zásady pro vypracování
1. Vypracování rešerše na téma diplomové práce
2. Určení netoxických koncentrací vybraných inhibitorů metodou MTT
3. Verifikace inhibičních účinků netoxických koncentrací inhibitorů na komplexy mTORC1/C2 metodou western blotting
4. Stanovení aktivity AhR metodou gene reporter assay v přítomnosti vybraných ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy
5. Analýza hladiny CYP1A1 mRNA metodou PCR v přítomnosti vybraných ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy
6. Stanovení enzymové aktivity CYP1A1 v přítomnosti vybraných ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy
7. Vypracování diplomové práce a multimediální prezentace k obhajobě diplomové práce
Seznam doporučené literatury
1. Shi-Yong Sun: mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs, 2013, Cancer Letters
2. Lamming DW et al: Rapalogs and mTOR inhibitors as anti-aging therapeutics, 2013, The Journal of Clinical Investigation
3. Liao H et al: Dramatic antitumor effects of the dual mTORC1 and mTORC2 inhibitor AZD2014 in hepatocellular carcinoma, 2015, American Journal of Cancer Research
4. Basu B et al: First-in-Human Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of the Dual m-TORC ? Inhibitor AZD2014, 2015, Clinical Cancer Research
5. Články publikované v odborných periodicích
Seznam doporučené literatury
1. Shi-Yong Sun: mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs, 2013, Cancer Letters
2. Lamming DW et al: Rapalogs and mTOR inhibitors as anti-aging therapeutics, 2013, The Journal of Clinical Investigation
3. Liao H et al: Dramatic antitumor effects of the dual mTORC1 and mTORC2 inhibitor AZD2014 in hepatocellular carcinoma, 2015, American Journal of Cancer Research
4. Basu B et al: First-in-Human Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of the Dual m-TORC ? Inhibitor AZD2014, 2015, Clinical Cancer Research
5. Články publikované v odborných periodicích
Přílohy volně vložené
CD ROM
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Obhajobu bakalářské práce studentky Bc. Karolíny Poulíkové zahájil prof. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Studentka seznámila komisi s hlavními částmi a výsledky své práce. Následovalo přečtení posudku vedoucího práce doc. Ing. Radima Vrzala, Ph.D. a oponenta prof. RNDr. Zdeňka Dvořáka, DrSc. et Ph.D.
Studentka pak reagovala na připomínky a dotazy.
Prezentace studentky obsahovala tato témata:
" Aryl uhlovodíkový receptor - funkce, aktivita
" Funkce mTOR kinázy
" Inhibitory mTOR kinázy
" Cíle práce
" Experimentální provedení práce
V rozpravě byly uvedeny následující připomínky či nastoleny tyto problémy:
" Vznik reaktivních elektrofilů v průběhu konjugačních reakcí
" Úloha mTOR kinázy při organizaci cytoskeletu
" Hranice nárůstu indukce luciferázové aktivity při posuzování intenzity potenciace
" Použité koncentrace studovaných látek a podmínky RTPCR
" Použité statistické metody
Studentka na dotazy položené oponentem práce a členy komise reagovala pohotově, věcně a přiměřeně.
Hodnocení: A