Informace o kvalifikační práci Príprava a analýza transgénnych línií jačmeňa exprimujúcich rekombinantný katelicidín pod kontrolou konštitutívneho či zrnovo špecifického promótoru
Antimikrobiálne peptidy predstavujú esenciálne komponenty vrodeného imunitného systému pravdepodobne všetkých živých organizmov. Tieto peptidy sú považované za liečivá novej generácie, a to vďaka svojmu širokospektrálnemu účinku a minimálnej cytotoxicite voči cicavčím bunkám. Principiálnou prekážkou pre ich komerčné uplatnenie je však vysoká výrobná cena produktu. Rekombinantné technológie s využitím intaktných rastlín pre ich produkciu, tzv. rastlinné molekulárne farmárčenie, poskytuje oproti ostatným produkčným systémom celú radu výhod vrátane teoreticky neobmedzenej produkčnej kapacity za relatívne nízku cenu. V rámci diplomovej práce boli pripravené transgénne rastliny jačmeňa s integrovaným transgénom kódujúcim chimérny antimikrobiálny peptid v jačmennom genóme. Transgénita línií jačmeňa bola overená pomocou PCR a následne bol určený stupeň ploídie pomocou prietokovej cytometrie. U diploidných GMO rastlín bol metódou Southern blot určený počet integrácií transgénu do genómu jačmeňa. Prítomnosť rekombinantného peptidu na proteínovej úrovni bola overená metódou Western blot. Taktiež bola potvrdená antimikrobiálna aktivita rekombinantného peptidu voči nepatogénnej baktérii. Záverom bola vysadená T1 generácia transgénnych línií jačmeňa pre následné analýzy.
Anotace v angličtině
Antimicrobial peptides are essential components of the innate immune system of probably all living organisms. These peptides are considered as new generation antibiotics due to their broad spectrum activity and minimal cytotoxicity towords mammalian cells. However, high production costs represent the main obstacle for their commercialization. Recombinant technology based on the use intact plants for AMPs production, so-called the plant molecular pharming, provides number of advantages over other production systems including theoretically unlimited production capacity for relatively low costs. During the research for diploma thesis, T0 generation of transgenic barley plants (Hordeum vulgare L.) harbouring transgenes coding for chimeric antimicrobial peptide were prepared. The transgenity of the barley lines was verified by PCR and then ploidy level was determined by flow cytometry. For diploid GMO plants, the number of transgene integrations into the barley genome was verified by Southern blot analysis. Presence of recombinant peptide on the protein level was verified by Western blotting. Furthermore, the antimicrobial activity of recombinant peptide against non-pathogenic bacteria was confirmed. Finaly, transgenic barley lines harboring one or two transgenes integration were propagated in the T1 generation for further analysis.
Antimikrobiálne peptidy predstavujú esenciálne komponenty vrodeného imunitného systému pravdepodobne všetkých živých organizmov. Tieto peptidy sú považované za liečivá novej generácie, a to vďaka svojmu širokospektrálnemu účinku a minimálnej cytotoxicite voči cicavčím bunkám. Principiálnou prekážkou pre ich komerčné uplatnenie je však vysoká výrobná cena produktu. Rekombinantné technológie s využitím intaktných rastlín pre ich produkciu, tzv. rastlinné molekulárne farmárčenie, poskytuje oproti ostatným produkčným systémom celú radu výhod vrátane teoreticky neobmedzenej produkčnej kapacity za relatívne nízku cenu. V rámci diplomovej práce boli pripravené transgénne rastliny jačmeňa s integrovaným transgénom kódujúcim chimérny antimikrobiálny peptid v jačmennom genóme. Transgénita línií jačmeňa bola overená pomocou PCR a následne bol určený stupeň ploídie pomocou prietokovej cytometrie. U diploidných GMO rastlín bol metódou Southern blot určený počet integrácií transgénu do genómu jačmeňa. Prítomnosť rekombinantného peptidu na proteínovej úrovni bola overená metódou Western blot. Taktiež bola potvrdená antimikrobiálna aktivita rekombinantného peptidu voči nepatogénnej baktérii. Záverom bola vysadená T1 generácia transgénnych línií jačmeňa pre následné analýzy.
Anotace v angličtině
Antimicrobial peptides are essential components of the innate immune system of probably all living organisms. These peptides are considered as new generation antibiotics due to their broad spectrum activity and minimal cytotoxicity towords mammalian cells. However, high production costs represent the main obstacle for their commercialization. Recombinant technology based on the use intact plants for AMPs production, so-called the plant molecular pharming, provides number of advantages over other production systems including theoretically unlimited production capacity for relatively low costs. During the research for diploma thesis, T0 generation of transgenic barley plants (Hordeum vulgare L.) harbouring transgenes coding for chimeric antimicrobial peptide were prepared. The transgenity of the barley lines was verified by PCR and then ploidy level was determined by flow cytometry. For diploid GMO plants, the number of transgene integrations into the barley genome was verified by Southern blot analysis. Presence of recombinant peptide on the protein level was verified by Western blotting. Furthermore, the antimicrobial activity of recombinant peptide against non-pathogenic bacteria was confirmed. Finaly, transgenic barley lines harboring one or two transgenes integration were propagated in the T1 generation for further analysis.
Teoretická časť:
-Popis biofarmaceutík vrátane prehľadu ich komerčnej dostupnosti.
-Spracovanie literárnej rešerše zameranej na antimikrobiálne peptidy, predovšetkým na mechanizmus ich pôsobenia, potenciálne využitie vo farmaceutickom priemysle a ďalej na popis expresných systémov, ktoré sú v súčasnosti využívané pre ich produkciu.
Praktická časť:
-Príprava transgénnych línií T0 generácie jačmeňa (Hordeum vulgare L.) cv. Golden Promise so stabilne integrovaným génom kódujúcim rekombinantný antimikrobiálny peptid zo skupiny katelicidínov, ktorého expresia je riadená konštitutívnym ubiquitínovým či zrnovo špecifickým B-hordeínovým promótorom.
-Selekcia diploidných, transgénnych línií T0 generácie jačmeňa a vypestovanie následnej T1 generácie transgénnych línií jačmeňa siateho (Hordeum vulgare L.) cv. Golden Promise a určenie počtu kópií inzertu.
-Analýza transgénnych línií jačmeňa na proteínovej úrovni, určenie približného množstva rekombinantného produktu a imunolokalizácia antimikrobiálneho peptidu v zrelých zrnách jačmeňa.
-Testovanie antimikrobiálnej aktivity rekombinantného produktu.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
Teoretická časť:
-Popis biofarmaceutík vrátane prehľadu ich komerčnej dostupnosti.
-Spracovanie literárnej rešerše zameranej na antimikrobiálne peptidy, predovšetkým na mechanizmus ich pôsobenia, potenciálne využitie vo farmaceutickom priemysle a ďalej na popis expresných systémov, ktoré sú v súčasnosti využívané pre ich produkciu.
Praktická časť:
-Príprava transgénnych línií T0 generácie jačmeňa (Hordeum vulgare L.) cv. Golden Promise so stabilne integrovaným génom kódujúcim rekombinantný antimikrobiálny peptid zo skupiny katelicidínov, ktorého expresia je riadená konštitutívnym ubiquitínovým či zrnovo špecifickým B-hordeínovým promótorom.
-Selekcia diploidných, transgénnych línií T0 generácie jačmeňa a vypestovanie následnej T1 generácie transgénnych línií jačmeňa siateho (Hordeum vulgare L.) cv. Golden Promise a určenie počtu kópií inzertu.
-Analýza transgénnych línií jačmeňa na proteínovej úrovni, určenie približného množstva rekombinantného produktu a imunolokalizácia antimikrobiálneho peptidu v zrelých zrnách jačmeňa.
-Testovanie antimikrobiálnej aktivity rekombinantného produktu.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
- Day R. N., Davidson M. W. (2009): The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews 38, 28872921.
- Furtado A., Henry R.J., Pellegrineschi A. (2009): Analysis of promoters in transgenic barley and wheat. Plant Biotechnology Journal 7, 240-253.
- Harwood W. A., Barlett J., Alves S., Perry M., Smedley M., Leyland N., Snape J. W. (2009): Barley transformation using Agrobacterium-mediated techniques. In: Methods in Molecular Biology, Transgenic Wheat, Barley and Oats, (Huw D., Shewry J., Shewry P. R., eds.), Springer, New York, U.S.A., 137-147.
- Christensen A. H. a Quail P. H. (1996): Ubiguitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research 5, 213-218.
- Sainsbury F., Jutras P. V., Vorster J., Goulet M.-C., Michaud D. (2016): A Chimeric Affinity Tag for Efficient Expression and Chromatographic Purification of Heterologous Proteins from Plants. Frontiers in Plant Science 7, 1-11.
- Sodoyer R. (2004): Expression systems for the production of recombinant pharmaceuticals. Biodrugs 18, 51-62.
- Soon.ja K., Renshu Q., Sung-Jin L., Hak-Kyo L., Joong-Kook CH. (2009): Antibacterial activity of recombinant hCAP18/LL37 protein secreted from Pichia pastoris. The Journal of Microbiology 47, 358-362.
Seznam doporučené literatury
- Day R. N., Davidson M. W. (2009): The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews 38, 28872921.
- Furtado A., Henry R.J., Pellegrineschi A. (2009): Analysis of promoters in transgenic barley and wheat. Plant Biotechnology Journal 7, 240-253.
- Harwood W. A., Barlett J., Alves S., Perry M., Smedley M., Leyland N., Snape J. W. (2009): Barley transformation using Agrobacterium-mediated techniques. In: Methods in Molecular Biology, Transgenic Wheat, Barley and Oats, (Huw D., Shewry J., Shewry P. R., eds.), Springer, New York, U.S.A., 137-147.
- Christensen A. H. a Quail P. H. (1996): Ubiguitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research 5, 213-218.
- Sainsbury F., Jutras P. V., Vorster J., Goulet M.-C., Michaud D. (2016): A Chimeric Affinity Tag for Efficient Expression and Chromatographic Purification of Heterologous Proteins from Plants. Frontiers in Plant Science 7, 1-11.
- Sodoyer R. (2004): Expression systems for the production of recombinant pharmaceuticals. Biodrugs 18, 51-62.
- Soon.ja K., Renshu Q., Sung-Jin L., Hak-Kyo L., Joong-Kook CH. (2009): Antibacterial activity of recombinant hCAP18/LL37 protein secreted from Pichia pastoris. The Journal of Microbiology 47, 358-362.
Přílohy volně vložené
1 CD
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
doc. Petřivalský: Kde je v zrnu detekovaná fluorescence, je signál nějak lokalizovaný?
dr. Danihlík: Jaká je doba inkubace peptidu s E. coli? Víte jak je peptid stabilní v roztoku, rozpadá se po nějaké době nebo ztrácí aktivitu?