Tato práce se zabývá studiem aktivního místa aldehyddehydrogenasy 21 (ALDH21) z mechu Physcomitrella patens. Teoretická část je zaměřena na rešerši současných poznatků o mechu P. patens a nadrodině rostlinných aldehyddehydrogenas. Praktická část zahrnuje místně-řízenou mutagenezi genu PpALDH21, heterologní expresi mutantních forem v Escherichia coli a purifikaci rekombinantních proteinů afinitní chromatografií. Čistota proteinů byla ověřena pomocí SDS-PAGE a sekundární struktura byla ověřena pomocí CD-spektroskopie. U jednotlivých variant PpALDH21 byly následně spektrofotometricky testovány změny v substrátové specificitě, kinetických parametrech a teplotní stabilitě. Výsledky ukazují na význam jednotlivých aminokyselinových reziduí v aktivním místě pro správnou katalytickou funkci enzymu a oxidaci preferovaného substrátu.
Anotace v angličtině
The thesis is focused on a study of the active site of aldehyde dehydrogenase 21 (ALDH21) from the moss Physcomitrella patens. The theoretical part summarizes the present knowledge of moss P. patens and plant aldehyde dehyderogenase superfamily. The practical part deals with site-directed mutagenesis of PpALDH21 gene, heterologous expression of the mutant variants in Escherichia coli and purification of recombinant proteins by affinity chromgatography. Purity of the final proteins was verified by SDS-PAGE and proper protein folding was confirmed by CD spectroscopy. Each PpALDH21 variant was subsequently spectrophotometrically assayed for changes in its substrate specificity, kinetic parameters and thermal stability. The results show the importance of individual amino acid residues in the active site for a proper catalytic function of the enzyme and oxidation of the preferred substrate.
Tato práce se zabývá studiem aktivního místa aldehyddehydrogenasy 21 (ALDH21) z mechu Physcomitrella patens. Teoretická část je zaměřena na rešerši současných poznatků o mechu P. patens a nadrodině rostlinných aldehyddehydrogenas. Praktická část zahrnuje místně-řízenou mutagenezi genu PpALDH21, heterologní expresi mutantních forem v Escherichia coli a purifikaci rekombinantních proteinů afinitní chromatografií. Čistota proteinů byla ověřena pomocí SDS-PAGE a sekundární struktura byla ověřena pomocí CD-spektroskopie. U jednotlivých variant PpALDH21 byly následně spektrofotometricky testovány změny v substrátové specificitě, kinetických parametrech a teplotní stabilitě. Výsledky ukazují na význam jednotlivých aminokyselinových reziduí v aktivním místě pro správnou katalytickou funkci enzymu a oxidaci preferovaného substrátu.
Anotace v angličtině
The thesis is focused on a study of the active site of aldehyde dehydrogenase 21 (ALDH21) from the moss Physcomitrella patens. The theoretical part summarizes the present knowledge of moss P. patens and plant aldehyde dehyderogenase superfamily. The practical part deals with site-directed mutagenesis of PpALDH21 gene, heterologous expression of the mutant variants in Escherichia coli and purification of recombinant proteins by affinity chromgatography. Purity of the final proteins was verified by SDS-PAGE and proper protein folding was confirmed by CD spectroscopy. Each PpALDH21 variant was subsequently spectrophotometrically assayed for changes in its substrate specificity, kinetic parameters and thermal stability. The results show the importance of individual amino acid residues in the active site for a proper catalytic function of the enzyme and oxidation of the preferred substrate.
1) Zpracování literární rešerše se zaměřením na mech Physcomitrella patens a nadrodinu rostlinných aldehyddehydrogenas
2) Exprese genu PpALDH21 v Escherichia coli, extrakce a purifikace rekombinantního proteinu
3) Místně řízená mutageneze PpALDH21 a purifikace mutantních variant
4) Měření sekundární struktury, molekulové hmotnosti, teplotní stability a kinetických parametrů mutantních variant PpALDH21.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Zásady pro vypracování
1) Zpracování literární rešerše se zaměřením na mech Physcomitrella patens a nadrodinu rostlinných aldehyddehydrogenas
2) Exprese genu PpALDH21 v Escherichia coli, extrakce a purifikace rekombinantního proteinu
3) Místně řízená mutageneze PpALDH21 a purifikace mutantních variant
4) Měření sekundární struktury, molekulové hmotnosti, teplotní stability a kinetických parametrů mutantních variant PpALDH21.
Závěrečná práce bude vypracována v souladu s doporučeným stylem pro závěrečné práce na oboru Biochemie PřF UP uvedeným na webové stránce Katedry biochemie (http://biochemie.upol.cz/index.php/cs/studium/zaverecne-prace).
Práce bude odevzdána na sekretariátě Katedry biochemie ve dvou svázaných výtiscích obsahujících CD s elektronickou verzí závěrečné práce, a to v řádném termínu uvedeném v harmonogramu Katedry biochemie.
Student je povinen vložit ekvivalentní elektronickou podobu závěrečné práce do systému STAG a doplnit povinné údaje o své práci (viz Opatření děkana Přírodovědecké fakulty UP v Olomouci k provedení některých ustanovení
Studijního a zkušebního řádu UP v Olomouci a Rigorózního řádu UP v Olomouci).
Seznam doporučené literatury
- Brocker Ch., Vasiliou M., Carpenter S., Carpenter Ch., Zhang Y., Wang X., Kotchoni S. O., Wood A. J., Kirch H. H., Kopečný D., Nebert D. W., Visiliou V. (2013): Aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily in plants: gene nomenclature and comparative genomics. Planta 237, 189-210.
- Hou Q., Bartels D. (2015): Comparative study of the aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene superfamily in the glycophyte Arabidopsis thaliana and Eutrema halophytes. Anals of Botany 115, 465479.
- Rensing S. A., Lang D., Zimmer A. D. et al. (2008): The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science 319, 64-69.
- Strotbek C., Krinninger S., Frank W. (2013): The moss Physcomitrella patens: methods and tools from cultivation to targeted analysis of gene function. The International Journal of Developmental Biology 57, 553564.
- Wood A.J., Duff R.J. (2009): The aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene superfamily of the moss Physcomitrella patens and the algae Chlamydomonas reinhardtii and Ostreococcus tauri. The Bryologist 112, 1-11.
Seznam doporučené literatury
- Brocker Ch., Vasiliou M., Carpenter S., Carpenter Ch., Zhang Y., Wang X., Kotchoni S. O., Wood A. J., Kirch H. H., Kopečný D., Nebert D. W., Visiliou V. (2013): Aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily in plants: gene nomenclature and comparative genomics. Planta 237, 189-210.
- Hou Q., Bartels D. (2015): Comparative study of the aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene superfamily in the glycophyte Arabidopsis thaliana and Eutrema halophytes. Anals of Botany 115, 465479.
- Rensing S. A., Lang D., Zimmer A. D. et al. (2008): The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science 319, 64-69.
- Strotbek C., Krinninger S., Frank W. (2013): The moss Physcomitrella patens: methods and tools from cultivation to targeted analysis of gene function. The International Journal of Developmental Biology 57, 553564.
- Wood A.J., Duff R.J. (2009): The aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene superfamily of the moss Physcomitrella patens and the algae Chlamydomonas reinhardtii and Ostreococcus tauri. The Bryologist 112, 1-11.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
-
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
V úvodu obhajoby předsedkyně komise doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. představila studentku přítomným akademickým pracovníkům a hostům. V rámci prezentace své práce studentka seznámila všechny zúčastněné s cíli práce a hlavními metodami využitými při jejím zpracování, dále se získanými výsledky a z nich vyplývajícími závěry.
Následně byl přečten oponentní posudek. Odpovědi na otázky a připomínky uvedené v posudku oponenta a vedoucího diplomové práce studentka zodpověděla uspokojivě, doložila je vypracované v písemné formě a prezentovala také ústně.
V rámci veřejné diskuse zodpověděla následující dotazy položené přítomnými odborníky:
doc. Petřivalský: Lze nějak porovnat afinitu substrátů k enzymu?
prof. Šebela: Který mutant je teplotně nejstabilnější? Při kolika stupních jste měřila aktivitu enzymu? Jak se změní kinetika enzymu při vyšší teplotě?