Předkládaná disertační práce je zaměřena na studium role S-nitrosoglutathionreduktasy (GSNOR, EC 1.1.1.284) a S-nitrosace u rostlin za fyziologických i stresových podmínek. GSNOR má klíčovou funkci v regulaci hladiny S-nitrosoglutathionu, zásobní a transportní formy oxidu dusnatého (NO) in vivo. GSNOR rovněž nepřímo reguluje hladinu ostatních
S-nitrosothiolů (RSNO) v buňkách. S-nitrosace, spočívající v reverzibilním navázání nitroso- skupiny na cysteinové thioly, představuje jednu z klíčových signálních drah NO u rostlin.
V rámci strukturně-funkční in vitro charakterizace rekombinantních enzymů GSNOR z lociky salátové a brukve květáku byla nalezena jejich podobnost s ostatními rostlinnými GSNOR. Studie zaměřená na posttranslační regulace aktivity rostlinných GSNOR in vitro potvrdila částečnou reverzibilní inhibici S-nitrosací a oxidačními modifikacemi cysteinových residuí v reduktasovém i dehydrogenasovém reakčním modu. Během vývoje lociky salátové
a brukve květáku bylo prokázáno, že aktivita GSNOR a hladiny RSNO mohou být o několik řádů odlišné mezi různými druhy rostlin. Významné rozdíly v hladinách GSNOR u genotypů Lactuca spp. s odlišnou rezistencí vůči plísni salátové ukázaly, že GSNOR je součástí obranných systémů rozdílně aktivovaných u neinfikovaných rostlin a regulace hladiny RSNO prostřednictvím aktivity GSNOR hraje důležitou roli v raném i pozdějším stádiu infekce biotrofními patogeny. Studium proteinové S-nitrosace u modelových rostlin rajčete infikovaných patogeny Phytophthora spp. odhalilo významnou regulační roli S-nitrosace
v obranných mechanismech při působení biotického stresu. Modulátory hladiny RNS
a abiotický stres významně ovlivnily metabolismus RNS, ROS a následně i vývoj kořene genotypů Solanum spp.. V souvislosti s modulací denitrosace zprostředkované GSNOR byla potvrzena regulace aktivity klíčových enzymů metabolismu ROS na úrovni S-nitrosace. Vlivem abiotického stresu došlo k rozdílné aktivaci obranných mechanismů u studovaných genotypů rajčete. Získané výsledky významně přispívají k hlubšímu poznání funkce GSNOR v regulaci S-nitrosace proteinů v signálních drahách NO při vývoji rostlin a odpovědi
na stresové podmínky.
Anotace v angličtině
The presented Ph.D. thesis is focused on the role of S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR, EC 1.1.1.284) and S-nitrosation in plants under physiological and stress conditions. GSNOR has a key role in regulation of S-nitrosoglutathione levels, the storage and transport form of nitric oxide (NO) in vivo. GSNOR also indirectly regulates levels of other
S-nitrosothiols (RSNO) in cells. S-nitrosation, based on the attachment of the nitroso group to cysteine thiols, has emerged as a new type of ubiquitous protein posttranslational modification within the complex network of NO bioactivity.
The structural and functional in vitro characterization of recombinant GSNOR enzymes from cauliflower and lettuce revealed their similarity to other plant GSNORs. A study focused on post-translational regulation of plant GSNORs activity in vitro confirmed partial reversible inhibition by S-nitrosation and oxidative modifications of cysteine residues in reductase and dehydrogenase reaction modes. During the cauliflower and lettuce development, GSNOR and RSNO levels were shown to be several orders of magnitude different among different plant species. Significant differences in GSNOR levels in Lactuca spp. genotypes with different resistance to lettuce downy mildew showed that GSNOR is an important component of defence systems differentially activated in non-infected plants, and regulation of RSNO levels through GSNOR activity plays an important role in early and late stages after infection with biotrophic pathogens. Study of protein S-nitrosation in Solanum spp. genotypes infected with Phytophthora spp. pathogens revealed an important regulatory role of S-nitrosation in defence mechanisms during biotic stress. Modulators of RNS levels and abiotic stress significantly affected the metabolism of RNS, ROS, and subsequently the development of roots Solanum spp. genotypes. In connection with the modulation of GSNOR-mediated de-nitrosylation it was confirmed that S-nitrosation regulates the activity of key enzymes of ROS metabolism. Abiotic stress differently activated the defensive mechanisms of the studied tomato genotypes. Obtained results contribute to deeper understanding of the GSNOR function in regulation of protein S-nitrosation in signalling pathways of NO in plant development and stress responses.
Klíčová slova
Brassica oleracea, Lactuca spp., Phytophthora spp., reaktivní formy dusíku, S-nitrosace, S-nitrosoglutathionreduktasa, Solanum spp., stres rostlin
Předkládaná disertační práce je zaměřena na studium role S-nitrosoglutathionreduktasy (GSNOR, EC 1.1.1.284) a S-nitrosace u rostlin za fyziologických i stresových podmínek. GSNOR má klíčovou funkci v regulaci hladiny S-nitrosoglutathionu, zásobní a transportní formy oxidu dusnatého (NO) in vivo. GSNOR rovněž nepřímo reguluje hladinu ostatních
S-nitrosothiolů (RSNO) v buňkách. S-nitrosace, spočívající v reverzibilním navázání nitroso- skupiny na cysteinové thioly, představuje jednu z klíčových signálních drah NO u rostlin.
V rámci strukturně-funkční in vitro charakterizace rekombinantních enzymů GSNOR z lociky salátové a brukve květáku byla nalezena jejich podobnost s ostatními rostlinnými GSNOR. Studie zaměřená na posttranslační regulace aktivity rostlinných GSNOR in vitro potvrdila částečnou reverzibilní inhibici S-nitrosací a oxidačními modifikacemi cysteinových residuí v reduktasovém i dehydrogenasovém reakčním modu. Během vývoje lociky salátové
a brukve květáku bylo prokázáno, že aktivita GSNOR a hladiny RSNO mohou být o několik řádů odlišné mezi různými druhy rostlin. Významné rozdíly v hladinách GSNOR u genotypů Lactuca spp. s odlišnou rezistencí vůči plísni salátové ukázaly, že GSNOR je součástí obranných systémů rozdílně aktivovaných u neinfikovaných rostlin a regulace hladiny RSNO prostřednictvím aktivity GSNOR hraje důležitou roli v raném i pozdějším stádiu infekce biotrofními patogeny. Studium proteinové S-nitrosace u modelových rostlin rajčete infikovaných patogeny Phytophthora spp. odhalilo významnou regulační roli S-nitrosace
v obranných mechanismech při působení biotického stresu. Modulátory hladiny RNS
a abiotický stres významně ovlivnily metabolismus RNS, ROS a následně i vývoj kořene genotypů Solanum spp.. V souvislosti s modulací denitrosace zprostředkované GSNOR byla potvrzena regulace aktivity klíčových enzymů metabolismu ROS na úrovni S-nitrosace. Vlivem abiotického stresu došlo k rozdílné aktivaci obranných mechanismů u studovaných genotypů rajčete. Získané výsledky významně přispívají k hlubšímu poznání funkce GSNOR v regulaci S-nitrosace proteinů v signálních drahách NO při vývoji rostlin a odpovědi
na stresové podmínky.
Anotace v angličtině
The presented Ph.D. thesis is focused on the role of S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR, EC 1.1.1.284) and S-nitrosation in plants under physiological and stress conditions. GSNOR has a key role in regulation of S-nitrosoglutathione levels, the storage and transport form of nitric oxide (NO) in vivo. GSNOR also indirectly regulates levels of other
S-nitrosothiols (RSNO) in cells. S-nitrosation, based on the attachment of the nitroso group to cysteine thiols, has emerged as a new type of ubiquitous protein posttranslational modification within the complex network of NO bioactivity.
The structural and functional in vitro characterization of recombinant GSNOR enzymes from cauliflower and lettuce revealed their similarity to other plant GSNORs. A study focused on post-translational regulation of plant GSNORs activity in vitro confirmed partial reversible inhibition by S-nitrosation and oxidative modifications of cysteine residues in reductase and dehydrogenase reaction modes. During the cauliflower and lettuce development, GSNOR and RSNO levels were shown to be several orders of magnitude different among different plant species. Significant differences in GSNOR levels in Lactuca spp. genotypes with different resistance to lettuce downy mildew showed that GSNOR is an important component of defence systems differentially activated in non-infected plants, and regulation of RSNO levels through GSNOR activity plays an important role in early and late stages after infection with biotrophic pathogens. Study of protein S-nitrosation in Solanum spp. genotypes infected with Phytophthora spp. pathogens revealed an important regulatory role of S-nitrosation in defence mechanisms during biotic stress. Modulators of RNS levels and abiotic stress significantly affected the metabolism of RNS, ROS, and subsequently the development of roots Solanum spp. genotypes. In connection with the modulation of GSNOR-mediated de-nitrosylation it was confirmed that S-nitrosation regulates the activity of key enzymes of ROS metabolism. Abiotic stress differently activated the defensive mechanisms of the studied tomato genotypes. Obtained results contribute to deeper understanding of the GSNOR function in regulation of protein S-nitrosation in signalling pathways of NO in plant development and stress responses.
Klíčová slova
Brassica oleracea, Lactuca spp., Phytophthora spp., reaktivní formy dusíku, S-nitrosace, S-nitrosoglutathionreduktasa, Solanum spp., stres rostlin
V teoretické části disertační práce je cílem shrnutí aktuálních poznatků
o S-nitrosoglutathionreduktase, klíčovém enzymu regulace metabolismu oxidu dusnatého v rostlinách a jeho funkci v odpovědi na stresové podmínky. Dalším cílem je shrnutí významu a funkce S-nitrosace u rostlin, a to včetně přehledu moderních metod analýzy S-nitrosovaných proteinů.
Cíle experimentální části disertační práce je možné rozdělit do několika dílčích projektů:
1. Studium role S-nitrosoglutathionreduktasy v časných a pozdních stádiích vývoje modelových rostlin Brassica oleracea var. botrytis a Lactuca spp..
2. Zapojení S-nitrosoglutathionreduktasy v modelových patosystémech Bremia lactucae, Pseudoidium neolycopersici a Golovinomyces cichoracearum u kulturních a planých druhů Lactuca spp..
3. Studium proteinové S-nitrosace a úlohy S-nitrosoglutathionreduktasy v průběhu patogeneze Phytophthora spp. u tří genotypů Solanum spp..
4. Analýza regulace aktivity S-nitrosoglutathionreduktasy prostřednictvím posttranslačních modifikací jejích cysteinových residuí.
5. Studium úlohy S-nitrosoglutathionreduktasy, S-nitrosace a reaktivních forem dusíku v procesu vývoje kořene s využitím modulátorů aktivity GSNOR (inhibitor, donor a lapač oxidu dusnatého) za fyziologických podmínek a v případě vystavení rostliny působení abiotických stresových faktorů.
Zásady pro vypracování
V teoretické části disertační práce je cílem shrnutí aktuálních poznatků
o S-nitrosoglutathionreduktase, klíčovém enzymu regulace metabolismu oxidu dusnatého v rostlinách a jeho funkci v odpovědi na stresové podmínky. Dalším cílem je shrnutí významu a funkce S-nitrosace u rostlin, a to včetně přehledu moderních metod analýzy S-nitrosovaných proteinů.
Cíle experimentální části disertační práce je možné rozdělit do několika dílčích projektů:
1. Studium role S-nitrosoglutathionreduktasy v časných a pozdních stádiích vývoje modelových rostlin Brassica oleracea var. botrytis a Lactuca spp..
2. Zapojení S-nitrosoglutathionreduktasy v modelových patosystémech Bremia lactucae, Pseudoidium neolycopersici a Golovinomyces cichoracearum u kulturních a planých druhů Lactuca spp..
3. Studium proteinové S-nitrosace a úlohy S-nitrosoglutathionreduktasy v průběhu patogeneze Phytophthora spp. u tří genotypů Solanum spp..
4. Analýza regulace aktivity S-nitrosoglutathionreduktasy prostřednictvím posttranslačních modifikací jejích cysteinových residuí.
5. Studium úlohy S-nitrosoglutathionreduktasy, S-nitrosace a reaktivních forem dusíku v procesu vývoje kořene s využitím modulátorů aktivity GSNOR (inhibitor, donor a lapač oxidu dusnatého) za fyziologických podmínek a v případě vystavení rostliny působení abiotických stresových faktorů.
Seznam doporučené literatury
1. D. E. Jensen, G. K. Belka and G. C. Du Bois, Biochem J., 1998, 331, 659-668.
2. L. Liu, A. Hausladen, M. Zeng et al., Nature 2001, 410, 490-494.
3. L. Kubienová, D. Kopečný, M. Tylichová et al., Biochimie, 2013, 95, 889-902.
4. M. C. Martínez, H. Achkor, B. Persson, et al., FEBS J, 1996,241,849-857.
5. A. Sakamoto, M. Ueda and H. Morikawa, FEBS Lett, 2002, 515, 20-24.
6. H. Achkor, M. Díaz, M. R. Fernandéz, et al., Plant Physiol., 2003, 132,2248-2255.
7. M. Díaz, H. Achkor, E. Titarenkob et al., FEBS Lett, 2003, 543,136-139.
8. O. Danielsson, H. Eklund and H. Jörnvall, Biochemistry, 1992, 31, 3751-3759.
9. J. O. Höög, J. J. Hedberg, P. Strömberg et al., J. Biomed. Sci, 2001, 8, 71-76.
10. U. Lee, C. Wie, B. O. Fernandez et al., Plant Cell, 2008, 20, 786-802.
11. M. Leterrier, M. Chaki, M. Airaki et al., Plant Signal. Behav., 2011, 6, 789-793.
12. M. Airaki, L. Sánchez-Moreno, M. Leterrier et al., Plant Cell. Physiol., 2011, 52, 2006-2015.
13. A. Feechan, E. Kwon, B. W. Yun et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 8054-8059.
14. Ch. Rustérucci, M. C. Espunya, M. Díaz et al., Plant Physiol., 2007, 143,1282-1292.
15. M. Chaki, A. M. Fernández-Ocaňa, R. Valderrama et al., Plant Cell Physiol, 2009, 50, 265-279.
16. J. B. Barroso, F. J. Corpas, A. Carreras et al., J. Exp. Bot., 2006, 57, 1785-1793.
17. F. J. Corpas, A. Carreras, F. J. Esteban et al. , Method. Enzymol, 2008, 437,561-574.
18. H. Wünsche, I. T. Baldwin and J. Wu , J. Exp. Bot., 2011, 62, 4605-4616.
19. M. Chaki, R. Valderrama, A. M. Fernández-Ocaňa et al., J. Exp. Bot., 2011, 62, 1803-1813.
20. M. Airaki, M. Leterrier, R. M. Mates et al., Plant Cell. Environ., 2012, 35,281-295.
21. M. Leterrier, M. Airaki, J. M. Palma et al., Environ. Pollut., 2012, 166, 136-143.
22. M. C. Espunya, R. de Michele, A. Gómez-Cadenas et al., J. Exp. Bot, 2012, 63, 3219-3227.
Seznam doporučené literatury
1. D. E. Jensen, G. K. Belka and G. C. Du Bois, Biochem J., 1998, 331, 659-668.
2. L. Liu, A. Hausladen, M. Zeng et al., Nature 2001, 410, 490-494.
3. L. Kubienová, D. Kopečný, M. Tylichová et al., Biochimie, 2013, 95, 889-902.
4. M. C. Martínez, H. Achkor, B. Persson, et al., FEBS J, 1996,241,849-857.
5. A. Sakamoto, M. Ueda and H. Morikawa, FEBS Lett, 2002, 515, 20-24.
6. H. Achkor, M. Díaz, M. R. Fernandéz, et al., Plant Physiol., 2003, 132,2248-2255.
7. M. Díaz, H. Achkor, E. Titarenkob et al., FEBS Lett, 2003, 543,136-139.
8. O. Danielsson, H. Eklund and H. Jörnvall, Biochemistry, 1992, 31, 3751-3759.
9. J. O. Höög, J. J. Hedberg, P. Strömberg et al., J. Biomed. Sci, 2001, 8, 71-76.
10. U. Lee, C. Wie, B. O. Fernandez et al., Plant Cell, 2008, 20, 786-802.
11. M. Leterrier, M. Chaki, M. Airaki et al., Plant Signal. Behav., 2011, 6, 789-793.
12. M. Airaki, L. Sánchez-Moreno, M. Leterrier et al., Plant Cell. Physiol., 2011, 52, 2006-2015.
13. A. Feechan, E. Kwon, B. W. Yun et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 8054-8059.
14. Ch. Rustérucci, M. C. Espunya, M. Díaz et al., Plant Physiol., 2007, 143,1282-1292.
15. M. Chaki, A. M. Fernández-Ocaňa, R. Valderrama et al., Plant Cell Physiol, 2009, 50, 265-279.
16. J. B. Barroso, F. J. Corpas, A. Carreras et al., J. Exp. Bot., 2006, 57, 1785-1793.
17. F. J. Corpas, A. Carreras, F. J. Esteban et al. , Method. Enzymol, 2008, 437,561-574.
18. H. Wünsche, I. T. Baldwin and J. Wu , J. Exp. Bot., 2011, 62, 4605-4616.
19. M. Chaki, R. Valderrama, A. M. Fernández-Ocaňa et al., J. Exp. Bot., 2011, 62, 1803-1813.
20. M. Airaki, M. Leterrier, R. M. Mates et al., Plant Cell. Environ., 2012, 35,281-295.
21. M. Leterrier, M. Airaki, J. M. Palma et al., Environ. Pollut., 2012, 166, 136-143.
22. M. C. Espunya, R. de Michele, A. Gómez-Cadenas et al., J. Exp. Bot, 2012, 63, 3219-3227.