|
Vyučující
|
|
|
|
Obsah předmětu
|
Úvod do proteomiky. Základní pojmy z oblasti separace proteinů (elektroforéza, chromatografie), hmotnostní spektrometrie, zpracování obrazu ("imaging"), využívání genových a proteinových databází. Význam expresní, diferenční a funkční proteomiky. Technologie proteomiky, aplikace. Identifikace a charakterizace proteinů v proteomice. Částečná separace proteinových směsí (konvenční chromatografie, afinitní chromatografie, preparativní elektroforéza). Jednorozměrná (1-D) elektroforéza - SDS/PAGE. Dvojrozměrná (2-D) elektroforéza. Příprava vzorku. První dimenze - isoelektrická fokusace (IEF). Amfolyty, trubičkové IEF gely. Proužky s imobilizovaným pH gradientem ("IPG strips"). Metodika a instrumentace IEF separace. Barvení IPG stripů. Druhá dimenze - SDS/PAGE. Složení pufrů. Příprava gelů. Instrumentace SDS/PAGE separace (horizontální a vertikální aparatury). Barvení proteinů v SDS/PAGE gelech, kompatibilita barvení a hmotnostní spektrometrie. Fluorescenční barvení gelů. Analýza obrazu, denzitometr, software pro vyhodnocení 2-D gelů. Srovnávání dvou a více 2-D gelů, diference. Vyřezávání (excize) proteinových spotů. Elektroeluce. Chemické a enzymové štěpení proteinů v gelu. Štěpení v roztoku. Obecné principy hmotnostní spektrometrie. Ionizační techniky využívané v proteomice. Ionizace elektrosprejem (ESI), ionizace s účastí matrice (MALDI). Iontové analyzátory, kvadrupól (Q), iontová past (IT), analyzátor doby letu (TOF), reflektron. Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) a její instrumentace. Technika MALDI-TOF post source decay (PSD). Peptidové mapování (peptide mass fingerprinting), sekvenční analýza peptidů (de novo sequencing). Identifikace proteinů vyhledáváním v databázích. Vyhledávací programy Mascot, Sequest a Protein Prospector. Organismy s nesekvenovaným genomem, EST databáze, program MS Blast. Multidimenzionální LC-MS/MS. Afinitní chromatografie a LC-MS/MS. Kvantitativní analýza v proteomice. Metody H2O18, ICAT, SILAC, AQUA. Shotgun proteomics - nástroj pro analýzu komplexních proteinových směsí. SELDI MS, klinická proteomika.
|
|
Studijní aktivity a metody výuky
|
Přednášení
- Účast na výuce
- 26 hodin za semestr
- Příprava na zkoušku
- 40 hodin za semestr
- Domácí příprava na výuku
- 1 hodina za semestr
|
|
Výstupy z učení
|
Základní seznámení s oborem proteomika. Základní pojmy, význam, metody, aplikace proteomiky.
Po absolvování kurzu by student měl být schopen: - popsat základní proteomické metody analýzy proteinů v biologickém materiálu - vysvětlit teoretický základ jednotlivých proteomických postupů využitelných při analýze proteinů v biologii - vybrat vhodnou metodu pro analýzu daného vzorku na základě požadovaných výsledků a typu vzorku - analyzovat proteiny ze získaných výsledků
|
|
Předpoklady
|
Jsou předpokládány základní znalosti z biochemie a analytické chemie.
|
|
Hodnoticí metody a kritéria
|
Známkou, Ústní zkouška
zkouška: Ústní, 2 otázky + 5 přehledných pojmů z přednášek
|
|
Doporučená literatura
|
-
Keough T., Lacey M. P., Youngquist R. S. (2000). Derivatization procedures to facilitate de novo sequencing of lysine-terminated tryptic peptides using postsource decay matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, Rapid Communication. Mass Spectrom. 14, 2348-2356.
-
Keough T., Youngquist R. S., Lacey M. P. (1999). A method for high-sensitivity peptide sequencing using postsource decay matrix-assisted laser desorption ionization mass spektrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7131-7136.
-
Marekov L. N., Steinert P. M. (2003). Charge derivatization by 4-sulfophenyl isothiocyanate enhances peptide sequencing by post-source decay matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 38, 373-377.
-
Pingoud A., Urbanke C., Hoggett J., Keltech A. (2002). Biochemical methods: A concise guide for students and researchers. Weinheim Německo.
-
Simson, R. J. (ed.). (2004). Purifying proteins for Proteomics: a laboratory manual.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
-
Wang D., Kalb S. R., Cotter R. J. (2004). Improved procedures for N-terminal sulfonation of peptides for matrix-assisted laser desorption/ionization post-source decay peptide sequencing, Rapid Communication. Mass Spectrom. 18, 96-102.
-
Westermeier, R., Naven, T. (2002). Proteomics in practice. A laboratory manual of proteome analysis.. Wiley-VCH, Weinheim, Germany.
-
Winter M., Sherman N. E. (2000). Protein sequencing and identification using tandem mass spectrometry. John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA.
|