1. Historie. Objev fluorescenčních proteinů, jejich přirozené zdroje a biologické funkce. Principy bioluminiscence. 2. Fyzikální, chemické a molekulární vlastnosti fluorescenčních proteinů. Třídimenzionální struktura a variace ve struktuře jako základ funkční variability. 3. Zelený fluorescenční protein z Aequorea victoria (GFP) a jeho mutované alelické formy. Změny v spektrálních vlastnostech, fotostabilitě a fototoxicitě. Typy a vlastnosti přirozeně se vyskytující fluorescenční proteiny z jiných druhů. 4. Spektrální vlastnosti fluorescenčních proteinů a jejich využití v buněčné biologii. Maturace fluorochromů a exprese excitačních a emisních vlastností. Problém dimerizace a oligomerizace, cílený vývoj monomerických forem. 5. Molekulární biologie rekombinantních GFP technologií. Klonování, vektory, konstrukce plazmidů pro transfer genů. Tvorba fúzních produktů fluorescenčních proteinů. Metody propagace, izolace a transformace. Sekvence chimerických genů. 6. Pasivní aplikace GFP technologií. Funkční fúze GFP a rekombinantní exprese. Buněčné markery, referenční geny, fúzní proteiny. 7. Spektrum využití GFP technologií u různých druhů organizmů. Aplikace ve funkčních buněčných studiích. 8. Specifické tagování fluorescenčních proteinů pro dynamické studium buněčných organel. Sledování dynamiky organel a GFP-fúzních proteinů, subcelulární lokalizace, vícebarevné snímání a kolokalizace. 9. Využití technologie fluorescenčních proteinů u rostlin: příprava konstruktů, transformace, exprese, detekce. Varianty fluorescenčních proteinů pro multispektrální detekci v živých buňkách. Exprese netoxických markerů neinvazní metodou v reálném čase. 10. Praktické aplikace studia živých buněk v reálném čase: Kvantitativní analýzy proteinů, jejich interakcí a dynamické redistribuce v buňkách metodami FRET, FLIM, FRAP, FLIP. Vizualizace molekulárních interakcí v živých buňkách bimolekulární fluorescenční komplementací. Princip, možnosti využití a aplikace. Fluorescenční korelační spektroskopie. 11. Optické varianty fluorescenčních proteinů a jejich aplikace. Fotoaktivace, fotokonverze, fotoindukce, časově?spektrální aktivace. 12. Geneticky kódované fluorescenční molekulární biosenzory: Aktivní aplikace GFP technologií na senzitivní detekci fyziologických a metabolických buněčných změn.
|